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Jun 12, 2023

Eine Hochdurchsatzmethode zur Eigrößenmessung bei Drosophila

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 3791 (2023) Diesen Artikel zitieren 735 Zugriffe 2 Zitate 4 Altmetrische Metrikdetails Lebensgeschichtliche Merkmale werden als Indikatoren für die Fitness bei Insekten verwendet, einschließlich

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 3791 (2023) Diesen Artikel zitieren

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2 Zitate

4 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Lebensgeschichtliche Merkmale werden als Indikatoren für die Fitness von Insekten, einschließlich Drosophila, verwendet. Die Eigröße ist ein adaptives und ökologisch wichtiges Merkmal, das möglicherweise genetische Unterschiede in verschiedenen Populationen aufweist. Der geringe Durchsatz bei der manuellen Messung der Eigröße hat jedoch die weit verbreitete Verwendung dieses Merkmals in der Evolutionsbiologie und Populationsgenetik behindert. Wir haben eine Methode zur genauen Hochdurchsatzmessung der Eigröße von Drosophila mithilfe der Großpartikel-Durchflusszytometrie (LPFC) entwickelt. Die Größenschätzungen mithilfe von LPFC sind genau und korrelieren stark mit den manuellen Messungen. Die Messung der Eigröße erfolgt mit hohem Durchsatz (durchschnittlich 214 gemessene Eier pro Minute) und lebensfähige Eier einer bestimmten Größe können schnell sortiert werden (durchschnittlich 70 Eier pro Minute). Die Sortierung nach LPFC verringert nicht die Überlebensrate der Eier und ist daher ein geeigneter Ansatz für die Sortierung von Eiern für nachgelagerte Analysen. Dieses Protokoll kann auf jeden Organismus innerhalb des nachweisbaren Größenbereichs (10–1500 µm) der großen Partikeldurchflusszytometer angewendet werden. Wir diskutieren die möglichen Anwendungen dieser Methode und geben Empfehlungen zur Optimierung des Protokolls für andere Organismen.

Die Eigröße ist ein wichtiges Merkmal bei Insekten, die sich als Reaktion auf entwicklungsbedingte und ökologische Belastungen entwickelt haben1. Die Eigröße und andere lebensgeschichtliche Merkmale (z. B. Überleben, Langlebigkeit und weibliche Fruchtbarkeit) sind Indikatoren für die Fitness von Insekten. Bei Drosophila melanogaster beeinflusst die Eigröße andere lebensgeschichtliche Merkmale, z. B. die Lebensfähigkeit des Embryos, die Schlupfrate und die Embryonalentwicklung2, sowie morphologische Merkmale wie die embryonale Anterior-Posterior-Strukturierung3,4. Larvendrängen5 und Umweltfaktoren wie die Temperatur beeinflussen die Eigröße von D. melanogaster6,7,8. Die Eigröße von D. melanogaster nimmt in Australien und Südamerika mit dem Breitengrad zu7, was darauf hindeutet, dass es sich um ein adaptives Merkmal unter stabilisierender Selektion handelt2. Drosophila ist einer der am häufigsten genutzten sexuellen Vielzeller in der Evolutionsbiologie. Diese Beliebtheit ist teilweise auf die kurze Generationszeit von Drosophila und die einfache Wartung unter Laborbedingungen zurückzuführen. Trotz der weit verbreiteten Verwendung von Drosophila wird die Eigröße in evolutionären und populationsbiologischen Studien selten untersucht, was teilweise auf den geringen Durchsatz bei der manuellen Messung der Eigröße zurückzuführen ist.

Traditionell wurde die Größe von Eiern gemessen, indem man sie unter einem Mikroskop oder Stereoskop betrachtete2,7,8,9,10. Alternativ werden die Eier unter einem Mikroskop fotografiert und ihre Größe manuell anhand der Bilder gemessen3,4,11,12. Kürzlich wurden einige Bildanalysetools entwickelt, um die Größe von Objekten automatisch zu berechnen13,14. Die Methoden, die auf manuellen Messungen beruhen, sind zeitaufwändig und mühsam, da die Eier vor der Aufnahme der Bilder manuell übertragen und in der richtigen Ausrichtung angeordnet werden müssen. Auch das manuelle Messen der Eigröße ist aufgrund der Voreingenommenheit des Experimentators fehleranfällig. Die Bildanalyse-Pipelines erfordern außerdem, dass die Proben vor einem Hintergrund mit einer bestimmten Farbe und Helligkeit fotografiert werden13. Darüber hinaus können manuelle Messungen oder Bildanalysetools in der Regel nicht die Gewinnung lebensfähiger Eier gewährleisten, die für nachfolgende Analysen verwendet werden können.

Die Durchflusszytometrie ermöglicht eine schnelle und genaue Sortierung und Größenmessung kleiner Objekte bis zu 200 µm. Aber die durchschnittliche Größe der Eier in der Untergruppe der D. melanogaster-Arten liegt zwischen 400 und 600 µm4,5,8,9,10, was zu groß ist, um mit herkömmlichen Durchflusszytometern verarbeitet zu werden. Das Aufkommen der Großpartikel-Durchflusszytometrie (LPFC) hat die Messung lebender Objekte bis zu 1500 µm ermöglicht. Die LPFC-Systeme arbeiten im Vergleich zu herkömmlichen Durchflusszytometern mit einer langsameren Flussrate und niedrigeren Drücken, um störende Scherkräfte zu vermeiden. LPFC wurde für die Analyse fluoreszierend markierter oder transgener Organismen verwendet, z. B. Eier von Nematoden15, D. melanogaster16 und Anopheles gambiae17 sowie Korallenlarven18. Auch nicht fluoreszierend markierte Objekte können auf LPFC allein nach ihrer Größe analysiert und sortiert werden. Ohne Fluoreszenzmarkierung beeinflusst jedoch die Form von Objekten die Genauigkeit der Größenschätzung. Beispielsweise ist die Form von Arabidopsis-Samen gestreckt kugelförmig oder kardioid19, sodass die Größenmessung von Arabidopsis-Samen nahezu unabhängig von der Ausrichtung der Samen ist20. Bei Objekten mit abgeflachter oder länglicher Ellipsoidform wie Drosophila-Eiern kann die geschätzte Größe jedoch je nach Ausrichtung der Objekte im Durchflusszytometer variieren. Die Größe des Objekts wird nur dann richtig gemessen, wenn die Objekte entlang ihrer Achse ausgerichtet sind. Sie kann jedoch unterschätzt werden, wenn die Objekte nicht entlang ihrer Achse verlaufen (Abb. 1A, B).

In-silico-Filterung von Schmutz und falsch ausgerichteten Objekten mithilfe der optischen Dichteprofile. (A) Drosophila-Eier sind elliptisch und eine genaue Größenmessung basierend auf der Flugzeit (TOF) wird erhalten, wenn ein Ei auf seiner Längsachse ausgerichtet ist. (B) Die Größe einer falsch ausgerichteten Eizelle, die auf ihrer kurzen Achse ausgerichtet ist, wird unterschätzt. Die falsch ausgerichteten Eier können anhand des Elliptikindex (EI) und des W/L-Verhältnisses identifiziert werden, wobei W die maximale optische Dichte eines Objekts und L die Anzahl der Extinktionsmessungen entlang der Flugzeit eines Objekts ist. (C) Die anfängliche Größenverteilung ist bimodal (keine Filterung). Der erste Modus entspricht Schmutz und Hefepartikeln, und die „Trümmerfilterung“ entfernt diese kleinen Objekte. Weitere Filterschritte basierend auf EI- und W/L-Parametern (Misalign-Filterung) entfernen die falsch ausgerichteten Eier. Die Größe wird in µm-Einheiten angegeben. Die Eilängenverteilung der Probe Dsim196 ist in C dargestellt: Die Statistik der Eilängenverteilung ist in den Tabellen S1 und S2 dargestellt, und das Histogramm der Eilängenverteilung ist in Abb. S3 dargestellt.

In dieser Studie haben wir eine Methode entwickelt, um die Länge von Drosophila-Eiern mithilfe von LPFC zu messen. Bei dieser Methode filtern wir in silico die Eier heraus, die entlang ihrer Längsachse nicht richtig ausgerichtet sind, und messen die Längenverteilung der Drosophila-Eier genau. Die Messung der Eilänge ist genau, schnell und hat einen hohen Durchsatz. Eier eines bestimmten Größenbereichs können genau sortiert und ohne Beeinträchtigung der Lebensfähigkeit zu erwachsenen Eiern entwickelt werden. Wir diskutieren das Potenzial dieses Ansatzes zur Untersuchung der natürlichen Variation und der genetischen Grundlage der Eigröße bei Drosophila. LPFC kann verwendet werden, um die Größe jedes Organismus innerhalb des nachweisbaren Bereichs (10–1500 µm) dieses Instruments zu messen. Wir geben Empfehlungen zur Optimierung des Einsatzes von LPFC für andere Organismen, insbesondere wenn deren Form vom Sphäroid abweicht.

Studien an D. melanogaster haben die Eilänge3,4,8,10, das Eivolumen2,6,7,11,12,21 oder sowohl die Länge als auch die Breite des Eies9 als Größenindikatoren verwendet. Das Eivolumen ist ein zusammengesetztes Maß, das normalerweise mit der Formel \(\frac{1}{6}\pi L{W}^{2}\) berechnet wird, wobei L, die Länge, der Achse der Rotationssymmetrie und W, die Breite, entspricht. ist die Achse senkrecht zur Länge1. Das Eivolumen kann zusammen mit der Gesamtzahl der Eier als Maß für die reproduktive Investition verwendet werden6. Wenn jedoch das Eivolumen als Indikator für die Größe verwendet wird, können die inter- oder intraspezifischen Unterschiede nicht direkt auf die Variation seiner Komponenten, dh Länge und Breite, zurückgeführt werden.

Ein Vorteil der Messung der Länge oder Breite von Eiern als Größenindikatoren besteht darin, dass sie als unterschiedliche Merkmale bewertet werden können. Diese Eigenschaften der Eigröße können bei verschiedenen Arten und Populationen unterschiedlich zur Variation der Eigröße beitragen. In künstlich selektierten Populationen für ein höheres Eivolumen ist beispielsweise gezeigt, dass die Eier länger sind12. Die funktionelle Validierung einiger in diesen Populationen identifizierter Kandidatengene hat auch gezeigt, dass diese Gene die Eilänge beeinflussen11. Dies deutet darauf hin, dass eine Zunahme der Eilänge (wahrscheinlich zusätzlich zur Zunahme der Eibreite) zum höheren Eivolumen beigetragen hat. In dieser Studie verwenden wir die Eilänge als Indikator für die Eigröße, da wir die Länge mit der von uns entwickelten Hochdurchsatzmethode genau messen können.

Tests zur Eilängenverteilung wurden mit 12 Inzuchtlinien von D. simulans22, Lausanne5 (D. melanogaster), Dere01 (D. erecta), Dsan01 (D. santomea) und Dmau151 (D. mauritiana) durchgeführt. Mit Ausnahme von D. simulans wurden alle Inzuchtlinien vom Bloomington Stock Center bezogen. Die restlichen Tests wurden mit einer Outbred-Population durchgeführt, die aus 97 D. simulans-Inzuchtlinien22 mithilfe eines Round-Robin-Kreuzungsschemas erstellt wurde. Wir haben die Kreuzungen 15 Generationen lang bei 25 °C gehalten und eine gleiche Anzahl Kreuzungen gemischt, um die Outbred-Population aufzubauen. Die Auszuchtpopulation und die Drosophila-Stämme wurden auf Standard-Drosophila-Medium bei 25 °C mit 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit täglich und 50–60 % Luftfeuchtigkeit gehalten. Die Enge der Larven5 und die Temperatur6,7,8 beeinflussen die Eigröße von D. melanogaster. Um die Auswirkungen auf die Umwelt zu reduzieren, hielten wir die Fliegenkulturen vor der Messung der Eigröße mindestens zwei Generationen lang mit einer Pipettiermethode23 bei niedriger Dichte (400 Eier/Flasche). Kurz gesagt, das Volumen der gewaschenen Eier wurde mit einer Reihe von Röhrchen verglichen, die ein bekanntes Volumen von 1 × PBS im Bereich von 50 bis 70 μl enthielten. Das Eiervolumen wurde auf 60 μl eingestellt, dann wurden 1200 μm 1 × PBS, also das 20-fache des Eiervolumens, zugegeben. 200 µl dieser Suspension enthielten durchschnittlich 400 Eier, die in eine Flasche überführt wurden. Das Protokoll kann angepasst werden, um den Unterschieden im Eivolumen verschiedener Arten und Populationen Rechnung zu tragen.

Etwa 500 4–6 Tage alte Individuen (Geschlechtsverhältnis ~ 50:50) wurden in einen Embryo-Sammelkäfig (Kat. Nr. 59–101, Genesee Scientific) mit einer 10-mm-Agarplatte (4 % Agar und 4 % Saccharose) überführt mit Hefepaste zur Erleichterung der Eiablage24. Obwohl das Alter der Weibchen keinen Einfluss auf die Eilänge hat4,8,10, haben wir die Messungen auf Eier beschränkt, die von 4–6 Tage alten Weibchen gelegt wurden. Wir haben die Eiablage auf 17–19 Stunden begrenzt, um das Schlüpfen der Eier zu verhindern. Zum Auflösen der Hefepaste wurden einige Tropfen lauwarmes Wasser auf die Agarplatte gegeben und die Hefe-Wasser-Lösung zusammen mit den Eiern mit einem Pinsel auf ein feines Netz übertragen. Die Eier wurden mit Wasser gewaschen, bis sich alle Hefekörner aufgelöst hatten. Anschließend wurden die Eier in ein 1,5-ml-Röhrchen mit 600 μl 1 × PBS überführt.

Wir ließen alle unsere Proben auf einem Biosorter® (Union Biometrica)-Gerät mit Fluidik- und Optik-Kernmontageeinheiten (FOCA) 1000 µm unter Verwendung von 1 × PBS als Mantellösung laufen. Um ein Verstopfen der Durchflusszelle zu verhindern, haben wir die Eier in 1 × PBS erneut suspendiert, sodass die Enddichte von ~ 400 Eiern/ml erreicht wurde. Wir haben die oben beschriebene Pipettiermethode23 verwendet, um die Eidichte anzupassen. Die Proben wurden kontinuierlich mit einem mechanischen Rührer in einem 50-ml-Probenbecher gerührt und zur Durchflusszelle transportiert, die von der Hülllösung (1 × PBS) umgeben war, die sie in die Mitte des Stroms fokussierte, wo sie von mehreren Lasern abgefragt wurden. Wir haben Biosorter® mit der FlowPilot™-Software unter Verwendung eines Druckprobenbechers 0,60–0,65 und eines Druckumlenkers 1,2 betrieben. Wenn Proben sortiert werden sollten, wurde ein Tropfen mit Flüssigkeit und dem sortierten Objekt erzeugt, der in den Sammelbehälter fiel. Wir haben Proben anhand der folgenden Parameter sortiert: Tropfenbreite von 22 ms (ms) und Sortierverzögerung von 28 ms. Wir haben den mechanischen Rührer mit destilliertem Wasser und das System mit 1 × PBS nach jedem Probendurchlauf gereinigt, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.

Das Durchflusszytometer für große Partikel misst zwei optische Eigenschaften der Objekte: die Flugzeit (TOF), die die Zeit angibt, die jedes Objekt das Licht blockiert, und die Extinktion (EXT), die durch das gesamte integrierte Signal des blockierten Lichts bestimmt wird (Abb. S1). . Wir haben die TOF von Polystyrol-Referenzkügelchen (200 und 430 µm) gemessen und ein lineares Regressionsmodell angepasst, wobei wir die TOF als Antwortvariable und die Größe als erklärende Variable verwendet haben. Mithilfe des geschätzten Achsenabschnitts und der geschätzten Steigung wurden die TOF-Messungen aller Proben in die Größe umgewandelt (Größe = 5,94 TOF – 491,78). Die FlowPilot™-Software ermöglicht die Echtzeitvisualisierung von EXT und TOF von Objekten als Streudiagramme und in diesem Diagramm können interessierende Bereiche, d. h. Tore, zum Sortieren von Objekten ausgewählt werden (Abb. S1). Basierend auf der mithilfe von TOF-Messungen geschätzten Größe wurden mehrere Tore eingerichtet, die unterschiedlichen Größenbereichen entsprachen (Abb. S1). Diese Tore wurden zum Sortieren von Eiern verwendet, die in 1 × PBS abgegeben wurden.

Die Größenverteilung der Eier in allen analysierten Proben war bimodal (Kurve „Keine Filterung“ in Abb. 1C). Die manuelle Untersuchung der Objekte im ersten Modus ergab, dass es sich bei den Objekten hauptsächlich um Trümmer und Hefepartikel handelte, während es sich bei den Partikeln im zweiten Modus ausschließlich um Drosophila-Eier handelte. Wir haben daher die Objekte herausgefiltert, die dem ersten Modus entsprachen, indem wir zunächst eine Kerndichteverteilung an die Größenverteilung angepasst und dann die Grenze zwischen den beiden Modi identifiziert haben. Kurz gesagt, wir haben die Kerndichteschätzung, die durch einen Glättungsparameter, dh die Bandbreite, gesteuert wird, an die Größenverteilung angepasst. Um eine geeignete Bandbreite zum Glätten der Dichteverteilung zu ermitteln, führten wir eine umfassende Suche über einen Bereich von Bandbreiten durch, indem wir die Kerndichtefunktion an eine Gaußsche Form anpassten. Wir führten eine K-Folds-Kreuzvalidierung durch, indem wir den Datensatz in Trainings- und Testsätze aufteilten. Wir teilen die Daten in fünf Teile auf; Vier Faltungen bildeten den Trainingssatz und eine Falte wurde als Validierungssatz verwendet. Als Bandbreite zur Glättung der Kerndichteverteilung wurde die beste Bandbreite mit der höchsten Punktzahl gewählt. Anschließend berechneten wir die Log-Likelihood jedes Datensatzes unter der angepassten Kerndichteverteilung und identifizierten die Grenze zwischen den beiden Modi als das erste Tal in der Log-Likelihood. Die Grenze zwischen den beiden Modi wurde als empirischer Größenschwellenwert für die Filterung von Hefepartikeln für jede Probe verwendet (Kurve „Trümmerfilterung“ in Abb. 1C).

Die Länge einer Fraktion von Eiern wurde von LPFC in allen Proben auf 200–400 µm geschätzt (Kurve „Trümmerfilterung“ in Abb. 1C), was kleiner ist als der Bereich der Drosophila-Eilänge, d. h. 400–600 µm4,5 ,8,9,10. Die manuelle Messung dieser Eier ergab, dass ihre Größe von LPFC wahrscheinlich aufgrund der Ausrichtung der Eier während der Messung unterschätzt wurde. Wenn ein längliches Ellipsoidobjekt den Laserweg entlang seiner Längsachse durchquert, entspricht der aufgezeichnete TOF seiner Länge (Abb. 1A). Wenn das Objekt jedoch falsch ausgerichtet ist, dh das Objekt nicht entlang der Längsachse verläuft, werden TOF und damit auch die Länge unterschätzt (Abb. 1B). Die Verwendung einer viskoseren Mantellösung, z. B. 1 × PBS mit 4 % Methylcellulose, verringert die Durchflussrate und erleichtert die Ausrichtung von Objekten entlang ihrer Längsachse beim Durchgang durch den Laserpfad (Abb. S2). Allerdings verringert die Viskosität der Hülllösung die Analysegeschwindigkeit drastisch.

Daher nutzten wir zusätzlich zur Trümmerfilterung die Informationen zur optischen Dichte, um falsch ausgerichtete Eier herauszufiltern, die nicht entlang ihrer Längsachse ausgerichtet waren. Die optische Dichte, die die Extinktion von Objekten misst, variiert in Abhängigkeit von der Struktur der Objekte (Abb. 1A, B). Wir haben die für ein Objekt aufgezeichnete maximale optische Dichte (W) und die Gesamtzahl der Extinktionsmessungen entlang der Flugzeit jedes Objekts (L) extrahiert und den Elliptikindex (\(EI= \frac{Area}{\pi /4LW}) berechnet. \)) ist das Verhältnis der Fläche unter dem optischen Dichteprofil eines Objekts zur Fläche des nächstgelegenen elliptischen Profils20,25. Aufgrund der elliptischen Form des Drosophila-Eies weist ein auf der Längsachse ausgerichtetes Ei ein kleineres W/L-Verhältnis auf als auf der kurzen Achse ausgerichtete Eier (Abb. 1A, B). Für jede Stichprobe haben wir EI und W/L für alle Objekte und zurückbehaltenen Objekte berechnet, die innerhalb der Hälfte der Standardabweichung um den Median von EI und W/L verteilt sind. Schließlich wurde nach dem Filtern von Objekten basierend auf EI und W/L der erste Modus der Verteilung der Drosophila-Eilänge, der den falsch ausgerichteten Eiern entspricht, ähnlich wie beim oben beschriebenen Trümmerfilterschritt herausgefiltert.

Um die Genauigkeit der geschätzten Eilänge mithilfe von LPFC zu validieren, haben wir die Länge von Eiern manuell und automatisch mithilfe von LPFC gemessen. Etwa 2000 Individuen aus der D. simulans-Auszuchtpopulation wurden in zwei Embryonensammelkäfige mit 10-mm-Agarplatten, die mit Hefepaste bedeckt waren, überführt und 17–19 Stunden lang Eier gelegt. Wir bereiteten Eier wie oben beschrieben für die Durchflusszytometrie vor und sortierten 74 Eier aus 6 Toren entsprechend 400–600 µm (mit Abständen von 50 µm) in einer 96-Well-Platte. Während der In-silico-Filterung (oben beschrieben) wurden die falsch ausgerichteten Eier mit der geschätzten durchschnittlichen Länge von 362 µm (N = 16 Proben, Tabelle S2) durch Biosorter® herausgefiltert. Daher stellt das Sortieren von Eiern aus Gattern mit einer geschätzten Länge von 400–600 µm sicher, dass keine falsch ausgerichteten Eier vorhanden sind. Anschließend haben wir die Länge der sortierten Eier manuell gemessen. Wir überführten die Eier in eine 100-mm-Petrischale mit einem dunklen Medium (4 % Agar und 0,5 % Holzkohle), positionierten die Eier auf der Rückseite und machten hochauflösende Fotos mit einem Leica-Stereomikroskop (M205 FA). Wir haben die Eilänge manuell mit ImageJ26 gemessen. Der Maßstab der Bilder wurde auf µm umgerechnet und die Eilänge wurde gemessen, indem eine Linie entlang der Längsachse jedes Eies gezogen wurde. Die Übereinstimmung zwischen den manuellen Längenmessungen und den automatisierten Längenschätzungen durch LPFC wurde mithilfe der Rangkorrelation nach Spearman getestet.

Darüber hinaus haben wir getestet, ob das Eintauchen in PBS die Eilängenmessung beeinflusst. Wir positionierten 46 Eier auf der Rückseite auf einer 100-mm-Petrischale mit einem dunklen Medium und machten hochauflösende Fotos. Wir haben die Eier 2,5 Stunden lang in eine 96-Well-Platte getaucht, sie dann auf ein dunkles Medium übertragen und hochauflösende Fotos gemacht. Wir haben die Eilänge manuell mit ImageJ gemessen, wie oben beschrieben. Die Übereinstimmung zwischen den Eilängenmessungen vor und nach dem Eintauchen in PBS wurde mithilfe der Pearson-Korrelation getestet.

Während der Eilängenmessung und -sortierung mit LPFC können Eier bis zu mehreren Stunden in PBS eingetaucht werden. Darüber hinaus verwendet LPFC zwar eine langsamere Flussrate und einen niedrigeren Druck als die herkömmliche Durchflusszytometrie, um sicherzustellen, dass die sortierten Objekte lebensfähig sind, der Durchgang durch das Durchflusszytometer kann jedoch das Überleben der Eier beeinträchtigen. Wir führten einen Test der Lebensfähigkeit von Eiern zu erwachsenen Eiern durch, um die Auswirkung des Eintauchens in PBS und des Durchgangs durch die Durchflusszelle auf die Entwicklung von Eiern zu erwachsenen Eiern zu bestimmen. Wir haben 17 bis 19 Stunden lang Eier gesammelt, die von einer D. simulans-Auszuchtpopulation gelegt wurden, wie oben in der manuellen Messung der Eilänge beschrieben. Um die Lebensfähigkeit der Eier vom Ei bis zum Erwachsenen ohne Einwirkung von PBS zu bestimmen, wurden die Eier auf der Agarplatte nicht mit PBS gewaschen („keine PBS“-Behandlung); 5 unabhängige Sätze von 50 Eiern wurden manuell gezählt und mit einem Pinsel in 5 Fläschchen überführt. Anschließend haben wir die auf die Hefepaste gelegten Eier gewaschen und etwa 30 μl Eier in drei 1,5-ml-Röhrchen mit 600 μl 1 × PBS überführt; 2 Röhrchen entsprachen „0-h“- und „4-h“-Behandlungen und 1 Röhrchen einer „sortierten 4-h“-Behandlung. Die Eier in 0-Stunden- und 4-Stunden-Behandlungen wurden nur 20 Minuten bzw. 4 Stunden lang bei Raumtemperatur (25 °C) gehalten. Für jede Behandlung wurden 5 unabhängige Sätze von 50 Eiern manuell unter einem Stereoskop gezählt und jeder Satz wurde in ein Fläschchen mit Standard-Drosophila-Medium überführt. Wir haben die Eier in der „sortierten 4-Stunden“-Behandlung auf LPFC laufen lassen und 7 unabhängige Sätze von 50 Eiern aus Gattern sortiert, die 400–600 μm entsprechen, also dem gesamten Bereich der Eilängenverteilung. Jeder Satz wurde in ein Fläschchen überführt. Die Anzahl der geschlüpften Erwachsenen aus jeder Durchstechflasche für alle Behandlungen wurde an 4 aufeinanderfolgenden Tagen gezählt, bis keine weiteren Fliegen mehr geschlüpft waren.

Um die Auswirkung des Eintauchens in PBS und der Sortierung durch LPFC auf die Lebensfähigkeit vom Ei zum erwachsenen Tier zu testen, haben wir ein verallgemeinertes lineares gemischtes Modell (unter Verwendung einer Binomialverteilung) mit der Behandlung, d. h. Eintauchzeit und Sortierstatus, als festen kategorialen Effekt mit 4 angepasst Ebenen (kein PBS, 0-h, 4-h und sortiert 4-h). Das verwendete Modell lautet wie folgt: Successij ~ μ + Treatmenti + Errorij, wobei Erfolg eine Matrix mit der Anzahl der überlebenden und toten Eier ist. Alle Behandlungen haben eine Stichprobengröße von 5 Wiederholungen, mit Ausnahme der sortierten 4-Stunden-Behandlung, die 7 Wiederholungen umfasst. Die Replikate wurden als Zufallseffekt einbezogen. Die Signifikanz des festen Effekts wurde mit ANOVA-F-Tests getestet und wir verwendeten Tukeys HSD zur Korrektur mehrerer Tests.

Die Längenverteilung aller Proben war bimodal (Abb. 1C) und die durchschnittliche Größe der 1. und 2. Mode betrug 92,38 und 412,21 µm (n = 16 Proben, Tabelle S1). Bei den Objekten im ersten Modus handelte es sich bei der manuellen Inspektion hauptsächlich um Trümmer und Hefepartikel. Wir haben die berechnete Grenze zwischen den beiden Modi als empirischen Größenschwellenwert verwendet, um die Objekte im 1. Modus zu entfernen. Diese probenspezifischen empirischen Schwellenwerte lagen zwischen 92,9 und 212,21 µm mit einem Durchschnitt von 184,29 µm (n = 16 Proben, Tabelle S1).

Der 2. Modus mit einer durchschnittlichen Größe von 412,21 µm (n = 16 Proben) entspricht der Länge von Drosophila-Eiern4,5,8,9,10, enthielt aber auch einige falsch ausgerichtete Eier (Abb. 1A,B). Die Länge falsch ausgerichteter Eier wurde von LPFC auf 200 bis 400 µm geschätzt (erster Peak in der Kurve „Trümmerfilterung“ in Abb. 1C), wurde jedoch wahrscheinlich aufgrund der falschen Ausrichtung der Eier während der Messung unterschätzt. Um die falsch ausgerichteten Eier zu filtern, haben wir den Elliptikindex (EI) und das Verhältnis der maximalen optischen Dichte eines Objekts zur Anzahl der Extinktionsmessungen entlang der Flugzeitwerte (W/L) eines Objekts berechnet, indem wir jeweils die optischen Dichtedaten verwendet haben Probe. Jeder Datensatz wurde weiter gefiltert, indem Eier entfernt wurden, die nicht auf der Längsachse ausgerichtet waren (Abb. 1B), indem Objekte mit EI- und W/L-Werten innerhalb der Hälfte der Standardabweichung um den Median beibehalten wurden. Als letzten Schritt zum Filtern der falsch ausgerichteten Eier haben wir die Objekte entfernt, die dem ersten Peak der Eiverteilung entsprechen (erster Peak in der Kurve „Trümmerfilterung“ in Abb. 1C). Diese Filterschritte entfernten keine Objekte mit großer Länge, was zeigt, dass die EI- und W/L-Parameter falsch ausgerichtete Eier, bei denen die Länge unterschätzt wurde, richtig identifizieren (Abb. 1C). Der berechnete probenspezifische empirische Schwellenwert zum Filtern dieser Objekte lag zwischen 163,36 und 317,12 µm, mit einem Durchschnitt von 317,12 µm (n = 16 Proben, Tabelle S2).

Wir haben die Genauigkeit der Eilängenmessungen und -sortierung mithilfe von LPFC validiert, indem wir die geschätzte Eilänge von LPFC mit den manuellen Messungen verglichen haben. Wir haben Eier von mehreren Toren sortiert, die 400 bis 600 μm entsprechen, wo keine falsch ausgerichteten Eier vorhanden sind, und die Länge der Eier manuell gemessen. Wir beobachteten eine hohe Korrelation zwischen den manuellen Messungen und der geschätzten Länge mithilfe von LPFC (Abb. 2A). Wir untersuchten außerdem die Auswirkung des Eintauchens in PBS auf die Eilänge. Die manuell gemessene Eilänge vor und nach 2,5 Stunden Eintauchen in PBS war stark korreliert (Abb. 2B).

Genauigkeit der geschätzten Eilänge mittels Großpartikel-Durchflusszytometrie. (A) Die durch manuelle Messung und Großpartikel-Durchflusszytometrie geschätzten Größen korrelieren stark (Rangkorrelation nach Spearman ρ = 0,84, p-Wert < 0,001). (B) Das Eintauchen in PBS hat keinen Einfluss auf die Eilänge, da die gemessene Eilänge vor und nach dem Eintauchen in PBS stark korreliert (Pearson-Korrelation r = 0,9, p-Wert < 0,001). Die Steigung der gestrichelten Linien in A und B beträgt 1.

Die Messung der Eilänge erfolgt mit hohem Durchsatz und schnell. Wir haben einen Durchschnitt von 316 Eiern/Minute gemessen, was 214 Eiern/Minute (n = 13 Proben) nach dem Herausfiltern der falsch ausgerichteten Eier entspricht (Abb. 3A). Wir haben die Effizienz der Sortierung als Sortierwiederherstellung bewertet. Dabei handelt es sich um den Prozentsatz der Objekte, die sortiert und ausgegeben wurden, als Bruchteil aller Objekte, die die Sortierkriterien (d. h. Größe) erfüllen. In unseren Händen betrug die mittlere Sortierausbeute 63,54 % (n = 28 Proben, Abb. 3B) und die mittlere Sortiergeschwindigkeit betrug 69 Eier/Minute (n = 28 Proben, Abb. 3C).

Durchsatz der Größenmessung und Sortierung von Eiern mittels Großpartikel-Durchflusszytometrie. (A) Die mittlere Geschwindigkeit der Eigrößenmessung beträgt 316 Eier/Minute nach der Filterung von Ablagerungen (Kurve „Trümmerfilterung“ in Abb. 1C) und 214 Eier/Minute (n = 13 Proben) nach der Filterung der falsch ausgerichteten Eier („Fehlausgerichtete Filterung“) ' Kurve in Abb. 1C). (B) Die mittlere Sortierausbeute als Schätzung der Sortiereffizienz beträgt 63,54 % (n = 28 Proben). (C) Die mittlere Sortiergeschwindigkeit beträgt 69 Eier/Minuten (n = 28 Proben).

Um die Eignung der Verwendung von LPFC für die Messung und Sortierung lebensfähiger Eier zu demonstrieren, haben wir getestet, ob sich die sortierten Eier normal zu erwachsenen Eiern entwickeln. Wir beobachteten keinen signifikanten Unterschied in der Lebensfähigkeit von Ei zu erwachsenem Tier zwischen Eiern, die nicht mit PBS gewaschen wurden (42,4 ± 3,36 von 50) und solchen, die 20 Minuten lang (40,74 ± 6,08 von 50) und 4 Stunden kurz in PBS eingetaucht wurden (43,2 ± 5,12 von 50) (Abb. 4, ein verallgemeinertes lineares gemischtes Modell, gefolgt von Tukeys HSD-Test mit Korrektur für Mehrfachtests, Pno-PBS-0 h = 0,7307, Pno-PBS-4 h = 0,9567, P0hour-4 h = 0,4405). Darüber hinaus zeigten Eier, die LPFC passierten, keinen Rückgang der Lebensfähigkeit vom Ei zum erwachsenen Tier (42,57 ± 3,6 von 50) im Vergleich zu Eiern, die für die gleiche Zeitdauer in 1 × PBS getaucht waren (43,2 ± 5,12 von 50) (Abb . 4, Pno-PBS-sortiert 4 h = 1,0000, P0hour-sortiert 4 h = 0,6673, P4hour-sortiert 4 h = 0,9540).

Die Lebensfähigkeit von Eiern wird durch das Eintauchen in PBS und das Sortieren mittels Großpartikel-Durchflusszytometrie nicht beeinträchtigt. Es gibt keinen signifikanten Unterschied in der Lebensfähigkeit von Eiern, die nicht mit PBS gewaschen wurden (kein PBS), und solchen, die 20 Minuten (0 Stunden) und 4 Stunden (4 Stunden) in PBS eingetaucht waren. Das Durchlaufen des Durchflusszytometers (sortiert 4 Stunden) verringert auch nicht die Lebensfähigkeit vom Ei zum erwachsenen Tier (ein verallgemeinertes lineares gemischtes Modell, gefolgt von Tukeys HSD-Test mit Korrektur für Mehrfachtests, Pno-PBS-0 h = 0,7307, Pno- PBS-4 h = 0,9567, P0hour-4 h = 0,4405, Pno-PBS-sortiert 4 h = 1,0000, P0hour-sortiert 4 h = 0,6673, P4hour-sortiert 4 h = 0,9540).

Hier etablieren wir eine Methode zur genauen und hohen Durchsatzmessung der Eilänge von Drosophila mithilfe der Durchflusszytometrie großer Partikel. Die Messung der Eilänge ist hochpräzise (Abb. 2), schnell und mit hohem Durchsatz (Abb. 3A). Lebensfähige Eier innerhalb eines bestimmten Längenbereichs können schnell sortiert werden (Abb. 3C), ohne dass die Lebensfähigkeit vom Ei zum Erwachsenen beeinträchtigt wird (Abb. 4).

Das Erhalten genauer und hoher Durchsatzgrößenmessungen von Drosophila-Eiern hat mehrere Anwendungen. Erstens ist diese Hochdurchsatzmethode ein geeigneter Ansatz für die Verwendung der Eilänge von Drosophila als lebensgeschichtliches Merkmal in groß angelegten Studien, in denen viele Populationen parallel analysiert werden sollen. Zweitens ermöglicht dieser Ansatz eine Hochdurchsatzanalyse der Variation der Eilänge in natürlichen Populationen verschiedener Arten von Drosophila. Drittens bietet der hohe Durchsatz der Eilängenmessung mittels Großpartikel-Durchflusszytometrie in Verbindung mit den verfügbaren Referenzpanels von D. melanogaster27 und D. simulans22 die Möglichkeit, die genetische Architektur der Eilängenvariation durch QTL-Kartierung und GWAS zu untersuchen. Viertens bietet diese Methode die Möglichkeit, lebensfähige Drosophila-Eier aus dem Bereich der Längenverteilung zu sortieren und Selektionsexperimente mit großen Populationen und Replikaten durchzuführen.

Die Möglichkeiten, die LPFC zur Messung der Größe des Organismus bietet, sind nicht auf Drosophila-Eier beschränkt und können auf jeden Organismus innerhalb des nachweisbaren Bereichs dieses Instruments (10–1500 μm) angewendet werden. Wir empfehlen, Vorversuche durchzuführen, um die Einstellungen des Geräts für die spezifische Probe und Anwendung zu optimieren. Zu den wichtigen Einstellungen zur Optimierung der Messung und Sortierung zählen unter anderem Durchflussrate, Mischgeschwindigkeit und Probendichte. Die Durchflussrate wird durch den Druck des Probenbechers angepasst und bestimmt die Anzahl der in einer Zeiteinheit analysierten Objekte. Im Biosorter®-Benutzerhandbuch wird empfohlen, die Durchflussrate so anzupassen, dass 10–30 Objekte pro Sekunde erreicht werden. Die Mischgeschwindigkeit sollte so angepasst werden, dass die Gegenstände nicht beschädigt werden, aber auch homogen im Puffer schweben. Die geeignete Probendichte ist ein Gleichgewicht zwischen Geschwindigkeit und Genauigkeit der Messung und Sortierung. Proben mit hoher Dichte können möglicherweise die Durchflusszelle verstopfen und auch zu ungenauen Größenmessungen führen, wenn Objekte vom Instrument nicht separat gemessen werden können. Einerseits können kontaminierte Ereignisse, das heißt die Objekte, die nicht den Sortierkriterien entsprechen und sich mit dem sortierbaren Objekt im selben Drop befinden, nicht sortiert werden. Daher kann eine zu hohe Dichte auch die Sortierausbeute verringern. Andererseits verlängern stark verdünnte Proben die Analyse. Das Gewicht der Objekte beeinflusst die Durchflussrate und Mischgeschwindigkeit der Analyse. Bei dichten und schweren Objekten wie Drosophila-Eiern sollte die Mischgeschwindigkeit hoch sein, um die Objekte in der Schwebe zu halten. Darüber hinaus darf der Druck des Probenbechers, der sich auf die Durchflussrate auswirkt, nicht zu niedrig sein, da bei zu niedrigem Druck möglicherweise Objekte gar nicht erst in die Durchflusszelle gelangen.

Die Anzahl der Eier in jedem Lauf sollte angepasst werden, um eine zuverlässige Schätzung der Größenverteilung zu gewährleisten. Unser In-silico-Filteralgorithmus hat für Proben mit 1.000–16.000 Eiern unterschiedliche Fraktionen identifiziert, die Ablagerungen und falsch ausgerichteten Eiern entsprechen (Tabelle S2). Der Filteralgorithmus muss jedoch möglicherweise zusätzlich optimiert werden, wenn zu wenige Objekte verfügbar sind.

Die Einstellungen des Instruments und die Filterschritte sollten entsprechend der Größe und Form der Objekte angepasst werden. Wenn die Größe des Objekts zu klein ist und die Größe des Schmutzes nicht übersteigt, ist möglicherweise eine intensivere Reinigung zur Entfernung des Schmutzes erforderlich. Bei Objekten, die eine annähernd kugelförmige Form haben, wie z. B. Arabidopsis-Samen19, hat die Ausrichtung des Objekts keinen Einfluss auf die von LPFC20 geschätzte Größe. Für Objekte mit Formen, die von einer Kugel abweichen, sind jedoch unterschiedliche Instrumenteneinstellungen und In-Silico-Filterschritte erforderlich. Die in dieser Studie entwickelte Methode ist für die Messung der Länge (Achse der Rotationssymmetrie) von länglichen Ellipsoidobjekten (z. B. der D. melanogaster-Artenuntergruppe) oder der Breite (Achse senkrecht zur Länge) von abgeflachten Ellipsoidobjekten optimiert. Wir empfehlen die Verwendung eines In-silico-Filterschritts ähnlich unserer Studie, um Schmutz und falsch ausgerichtete Objekte zu entfernen. Darüber hinaus wird durch die Verwendung einer viskosen Mantellösung zur Reduzierung der Durchflussrate die Anzahl falsch ausgerichteter Objekte minimiert (Abb. S2). Eine geringere Durchflussrate verringert jedoch die Analysegeschwindigkeit. Darüber hinaus kann die durchschnittliche maximale Höhe der optischen Dichte (W), die wir zum Filtern falsch ausgerichteter Objekte verwendet haben, auch in Kombination mit anderen Sortierkriterien, z. B. der Größe, verwendet werden, um die Effizienz der Objektsortierung zu erhöhen. Wenn die Messung der Breite eines prolaten Ellipsoidobjekts oder der Länge eines abgeflachten Ellipsoidobjekts erforderlich ist, sollten die Laufspezifikationen optimiert werden, um den Anteil der Objekte in der gewünschten Ausrichtung zu maximieren, die von LPFC gemessen werden sollen. Darüber hinaus sollten die In-silico-Filterschritte angepasst werden, um die falsch ausgerichteten Objekte zu entfernen. Wir empfehlen, die Sortierung der Objekte nach der Größe anhand des Größenbereichs (z. B. Gate) durchzuführen, damit sichergestellt ist, dass keine falsch ausgerichteten Objekte vorhanden sind.

Große Partikeldurchflusszytometer sind teure Instrumente, die von kleinen Forschungsgruppen möglicherweise nicht leicht erworben werden können. Viele Forschungseinrichtungen verfügen jedoch über solche Instrumente, die Forschern den Zugang ermöglichen können. Die meisten Forschungseinrichtungen verfügen über geschultes Personal, das Forscher unterstützen und schulen kann.

Alle Daten und Codes zur Reproduktion der Ergebnisse sind unter https://github.com/NedaBarghi/EggSizeBiosorterProtocol hinterlegt.

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Zur Sortierung wurde das BioSorter® Large Particle Flow Cytometer (Union Biometrica, Holliston, MA) der Max Perutz Labs BioOptics FACS Facility (https://www.maxperutzlabs.ac.at/research/facilities/biooptics-facs) verwendet. Wir danken Johanna Stranner und Kitti Dora Csalyi für ihre Hilfe bei der Optimierung des Sortierprotokolls. Wir danken Paula Marconi für ihre Hilfe beim Test der Lebensfähigkeit von Eizellen zu erwachsenen Tieren. Wir danken Emmanouil Lirakis für die Unterstützung bei der Verwendung des Leica-Stereomikroskops. Diese Arbeit wurde vom Österreichischen Wissenschaftsfonds (FWF, P 32672) an NB gefördert. Wir danken Sara Signor (North Dakota State University) für die Bereitstellung von D. simulans-Inzuchtlinien. Die Drosophila-Stämme Lausanne5 (D. melanogaster), Dere01 (D. erecta), Dsan01 (D. santomea) und Dmau151 (D. mauritiana) werden von Robert Kofler vom Bloomington Stock Center bezogen. Wir danken Samuel Church und den anonymen Gutachtern für konstruktive Kommentare zum Manuskript.

Institut Für Populationsgenetik, Vetmeduni Vienna, Veterinärplatz 1, 1210, Vienna, Austria

Neda Barghi und Claudia Ramirez-Lanzas

Vienna Graduate School of Population Genetics, Vetmeduni Vienna, Wien, Österreich

Claudia Ramirez-Lanzas

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NB konzipierte die Ideen und entwarf die Methodik; NB und CR-L. die Daten gesammelt; NB analysierte die Daten und leitete die Erstellung des Manuskripts. Alle Autoren haben sich kritisch an den Entwürfen beteiligt und die endgültige Freigabe zur Veröffentlichung erteilt.

Korrespondenz mit Neda Barghi.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Barghi, N., Ramirez-Lanzas, C. Eine Hochdurchsatzmethode zur Eigrößenmessung bei Drosophila. Sci Rep 13, 3791 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30472-8

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Eingegangen: 23. Dezember 2022

Angenommen: 23. Februar 2023

Veröffentlicht: 07. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30472-8

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